Next-Generation-Sequencing in der Epigenetik

Das menschliche Genom enthält ca. 20.000 Gene, von denen viele – mit Ausnahme von konstitutionell exprimierten Genen – nur in bestimmten Entwicklungsstufen, in bestimmten Zelltypen und zu bestimmten Zeiten aktiv sind. Das koordinierte An- und Ausschalten von Genen erfolgt durch genregulatorische Netzwerke, oft angestoßen durch extrazelluläre Signale. Dabei bestimmen Transkriptionsfaktoren einerseits die Aktivität und lokalen Chromatinzustände ihrer Zielgene, andererseits beeinflussen die Chromatinzustände die Kinetik der Bindung von Transkriptionsfaktoren an ihre Bindestellen.

Chromatinzustände sind hauptsächlich charakterisiert durch das Methylierungsmuster der DNA, die posttranslationale Modifikation von Histonen sowie die relative Position von Nukleosomen (Abb. 1a). Die DNA-Methylierung betrifft fast ausschließlich die Methylierung der Base Cytosin in CpG-Dinukleotiden. Histone können an verschiedenen Aminosäureseitenketten acetyliert, methyliert oder anderweitig modifiziert sein. Nukleosomenfreie DNA-Abschnitte erleichtern die Bindung von Transkriptionsfaktoren und der RNA-Polymerase an die DNA. Schließlich können Enhancer/Transkriptionsfaktorkomplexe über eine große Distanz hinweg mit Promotoren interagieren, und zwar durch Schleifenbildung des Chromatins (Abb. 1b); d. h., auch die 3‑D-Struktur des Genoms spielt eine Rolle bei der Regulation der Genexpression. Diese epigenetischen Veränderungen sind in der Regel mitotisch stabil, können aber von Transkriptionsfaktoren durch die Rekrutierung von DNA-Methyltransferasen und -Demethylasen, von histonmodifizierenden Enzymen sowie von Nukleosom-Remodelling-Komplexen verändert werden. Die Gesamtheit aller epigenetischen Veränderungen (das Epigenom) spiegelt die Identität von Zelltypen in normalen, altersbedingten und krankheitsbedingten Situationen wider.

Aberrante epigenetische Muster an spezifischen Genorten werden Epimutation genannt [12], wobei zwischen primären und sekundären Epimutationen unterschieden wird [13]. Sekundäre Epimutationen sind Folge einer genetischen Mutation am oder in der Nähe des betroffenen Genorts. Ein Beispiel für eine sekundäre Epimutation ist die Methylierung des MSH2-Promoters infolge einer Deletion des 3′-Endes des benachbarten EPCAM-Gens in einigen Familien mit Lynch-Syndrom. Die Deletion führt zu einer EPCAM-Transkription durch den MSH2-Promoter und so zu dessen De-novo-Methylierung [20]. Weiterhin kann eine sekundäre Epimutation die Folge einer Mutation in einem epigenetischen Regulator (z. B. DNA-Methyltransferasen oder histonmodifizierende Enzyme) sein [17], wodurch in der Regel sehr viele Loci betroffen sind. Sekundäre Epimutationen sind sehr viel häufiger als primäre, die ohne eine genetische Veränderung aufgetreten sind. Klassisches Beispiel für eine primäre Epimutation sind Imprintingfehler, bei denen eine aberrante DNA-Methylierung vorliegt, aber eine Mutation im Imprintingzentrum ausgeschlossen wurde [2]. Da fast alle Epimutationen postzygotisch entstehen, liegen sie oft im Mosaik vor, was ihren Nachweis erschwert. Es ist umstritten, inwieweit Blut verwendet werden kann, um Epimutationen an Genen zu identifizieren, die nur in anderen Geweben, z. B. im Gehirn, exprimiert werden. Krebszellen weisen in der Regel eine globale DNA-Hypomethylierung [8] und eine lokale Hypermethylierung (Methylierung von Tumorsuppressorgenen) auf [9]. Bislang wurde bei Krankheitsgeschehen und Alterungsprozessen nur nach aberranten DNA-Methylierungsmustern gesucht. Im Prinzip sind aber auch aberrante Histonmodifikationen denkbar, insbesondere die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 27 (H3K27me3) betreffend (siehe auch unten). Diese Markierung charakterisiert Polycomb-reprimiertes Chromatin, das ähnlich stabil wie die DNA-Methylierung ist. Diese Möglichkeit wurde bislang beim Menschen nicht erforscht.

Die Analyse des gesamten Epigenoms ist erst mit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenziertechniken und spezieller Auswertealgorithmen möglich geworden. Durch die Anstrengungen vieler Arbeitsgruppen im Rahmen des International Human Epigenome Consortiums (IHEC) und anderer Konsortien stehen inzwischen große Datensätze von vielen menschlichen Geweben und Zellen zur Verfügung. Leider wurden und werden allzu oft nicht genau spezifizierte Mischungen verschiedener Zelltypen (Blut oder andere Gewebe) untersucht. Eine unterschiedliche Zellzusammensetzung verschiedener Gewebsproben kann bei vergleichenden Analysen epigenetische Unterschiede vortäuschen, die nicht existieren. Zur Vermeidung dieses Problems sollte eine möglichst homogene Zellpopulation untersucht werden, z. B. Monozyten, B‑Zellen oder T‑Zellen statt Vollblut. Außerdem wird oft übersehen, dass genetische Variation einen großen Einfluss auf die epigenetische Variation hat [23]. Zum Ausschluss genetisch bedingter epigenetischer Variation sollte deshalb angestrebt werden, isogene Vergleiche durchzuführen, z. B. ein Vergleich von verschieden Zelltypen ein und desselben Individuums oder ein Vergleich desselben Zelltyps eines Individuums vor und nach einer Intervention.

Methoden zur Untersuchung der DNA-Methylierung basieren meist auf der Behandlung von einzelsträngiger DNA mit Natriumbisulfit [4]. Durch diese Behandlung wird Cytosin, aber nicht 5‑Methylcytosin in Uracil umgewandelt. Bei einer nachfolgenden Polymerasekettenreaktion (PCR) wird Thymin anstelle von Uracil in die DNA eingebaut. Zeigt die anschließende DNA-Sequenzierung im Vergleich zur Referenzsequenz ein T statt C, war das ursprüngliche Cytosin unmethyliert. Zeigt sie ein C, war das ursprüngliche Cytosin methyliert oder hydroxymethyliert. 5‑Hydroxymethylcytosin, das bis auf embryonale Stammzellen und Neuronen oft nur in sehr geringer Konzentration vorliegt, wird deshalb in der Regel vernachlässigt. Es kann aber durch oxidative Bisulfitsequenzierung bestimmt werden. Bis sich bisulfitfreie Verfahren (enzymatische Methoden zur Unterscheidung von Cytosin, 5‑Methylcytosin und 5‑Hydroxymethylcytosin oder der direkte Nachweis modifizierter Basen während der Sequenzierung) durchgesetzt haben, bleibt die Bisulfitsequenzierung der Goldstandard für die basengenaue DNA-Methylierungsanalyse.

Die DNA, und zwar jeweils 146 bp, ist um Histon-Oktamere gewickelt, meistens bestehend aus zwei Histonen H2A, zwei Histonen H2B, zwei Histonen H3 und zwei Histonen H4. Die N‑terminalen Enden der Histone sind in der Regel an vielen Aminosäureseitenketten posttranslational modifiziert. Lysinseitenketten z. B. können acetyliert oder methyliert sein, Serinseitenketten z. B. phosphoryliert. Insgesamt gibt es dabei eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten, obwohl viele Modifikationen hochgradig korreliert oder antikorreliert sind. Häufig werden folgende Modifikationen untersucht: H3K27ac (Acetylierung von H3 an Lysin 27), H3K4me1, H3K4me3, H3K36me3, H3K27me3 und H3K9me3 (Bedeutung analog). H3K27ac markiert aktive Promotoren und Enhancer. H3K4me1 Enhancer, H3K4me3 Promotoren, H3K36me3 transkribierte DNA, H3K27me3 Polycomb-reprimierte DNA und H3K9me3 Heterochromatin. Durch die Bestimmung dieser sechs Modifikationen können verschiedene Chromatinzustände einer Region mittels Kombinatorik und des ChromHMM-Algorithmus [7] noch weiter differenziert werden, z. B. in aktive TSS, aktive TSS-Umgebung, bivalente TSS, intergener Enhancer, transkribierter Enhancer, bivalenter Enhancer, starke Transkription, schwache Transkription, ZNF-Gene und Repeats, starke Polycomb-Repression, schwache Polycomb-Repression, Heterochromatin und stummes Chromatin. Mit dieser Information können regulatorische Elemente im Genom identifiziert und die funktionelle Auswirkung von Sequenzvarianten abgeschätzt werden, die beim „whole-genome sequencing“ (WGS) außerhalb von Exomen gefunden werden.

Zur genomweiten Bestimmung der Anreicherung bestimmter Histonmodifikationen in bestimmten Regionen wird eine ChIP-seq durchgeführt. Dafür wird das Chromatin zunächst mit Formaldehyd fixiert, wobei die Histone kovalent an die DNA gebunden werden. Nach Fragmentierung des Chromatins auf eine Größe von 150–500 bp wird eine Immunopräzipitation mithilfe von Antikörpern gegen bestimmte Histonmodifikationen wie z. B. H3K4me3 durchgeführt. Es ist von äußerster Wichtigkeit, dass hier hochspezifische Antikörper eingesetzt werden. Aus dem gereinigten Präzipitat werden dann die zuvor gebundenen DNA-Fragmente freigesetzt und nach Herstellung einer Sequenzierbibliothek massiv parallel sequenziert. Für die spätere Normalisierung ist eine ChIP mit unspezifischem IgG notwendig. Es sollten mindestens 50.000.000 reads mit mindestens 36 bp-Länge erzeugt werden. Die erhaltenen Sequenzen werden dann gegen das Referenzgenom kartiert. Anschließend wird die Anreicherung von „reads“ entlang des Genoms bestimmt. Abb. 4 zeigt einen IGV-Screenshot einer Region auf Chromosom 19 in Monozyten (Mo) und den daraus differenzierten Makrophagen (Mac). Es ist leicht erkennbar, dass ein Cluster von miRNA- und lncRNA-Genen auf Chromosom 19 während der Differenzierung aktiviert wird: das Signal der aktiven Histonmarkierungen (obere vier Doppelspuren) nimmt zu, das Signal für Polycomb-reprimiertes Chromatin (fünfte Doppelspur) nimmt ab. Das 5′ liegende Chromatin (ein CGI) ist schon in Monozyten frei von DNA-Methylierung, aber das Chromatin öffnet sich erst während der Differenzierung (NOMe-seq „peaks“).

Die dreidimensionale Faltung des Chromatins kompartimentiert das Genom und kann entfernt liegende funktionelle Elemente, wie z. B. Enhancer und Promotoren, räumlich zusammenbringen (Abb. 1b). HiC ist eine „chromosome conformation capture“ Methode, mit der genomweit räumlich benachbarte DNA-Sequenzen identifiziert werden können [19]. Bei dieser Methode werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, sodass interagierende Loci durch kovalente DNA-Protein-Vernetzungen verbunden bleiben. Die DNA wird dann mit einem häufig schneidenden Restriktionsenzym geschnitten, die Enden mit biotinylierten Nukleotiden aufgefüllt und diese in großer Verdünnung ligiert. Dadurch wird eine Bibliothek von Ligationsprodukten = räumlich benachbarten DNA-Sequenzen generiert, die mittels Streptavidin aufgereinigt und nach Adaptorligation massiv parallel sequenziert und gegen das Referenzgenom kartiert werden. Je häufiger zwei DNA-Sequenzen interagieren, desto häufiger sind sie in der Bibliothek vertreten. Aus diesen Daten lassen sich Chromosomenterritorien sowie toplogisch assoziierende Domänen (TAD) identifizieren, die durch Grenzen („boundaries“) voneinander abgegrenzt sind (Abb. 5). In der Regel können Enhancer nur mit Promotoren in derselben TAD interagieren. Der Verlust einer Grenze durch eine Deletion kann es Enhancern innerhalb einer TAD ermöglichen, in aberranter Weise mit Promotoren einer anderen TAD zu interagieren. Eine solche „enhancer adoption“ [22] kann zu genetischen Erkrankungen führen. Dies ist natürlich keine Epimutation, sondern ein neu entdeckter Mechanismus, über den sich eine DNA-Veränderung (Deletion) auf die Genexpression auswirken kann.